В 2004 г. Zychlinsky et al. было описано явление нейтрализации патогенных микроорганизмов нейтрофилами с помощью образуемых ими внеклеточных структур, названных «нейтрофильными внеклеточными ловушками» (НВЛ; Neutrophil Extracellular Traps — NETs). Так как в процессе образования ловушек нейтрофил гибнет, то механизм их образования был назван НЕТоз, по аналогии с апоптозом и некрозом [1].
В литературе имеются сведения о количестве НВЛ у здоровых доноров, которое составило 5,7 ± 2,5 %, Min-Max: 1,8–11,9 % [2].
Многочисленные исследования показывают, что образование НВЛ играет важную роль в патогенезе таких заболеваний, как системная красная волчанка [3], преэклампсия [4, 5], сепсис [6–8], муковисцидоз [9], иммунокомплексные заболевания [10], воспалительные заболевания кишечника [11], атеросклероз [12], антифосфолипидный синдром [13, 14].
При преэклампсии снижение перфузии плаценты связано в том числе с повышенным высвобождением воспалительных мембранных микрочастиц микроволокон синцитиотрофобласта и цитокинов в ответ на первичную гипоксию, вызванную изначальным нарушением инвазии трофобласта. Увеличение уровня микроволокон синцитиотрофобласта было выявлено в крови у женщин с преэклампсией. Исследования показали, что микроволокна синцитиотрофобласта разрушают эндотелий и ингибируют пролиферацию эндотелиальных клеток в культуре и эндотелий-зависимую релаксацию мелких артерий in vitro [15–18]. Было выдвинуто предположение, что при недостаточной перфузии в плаценте при преэклампсии образуются активные формы кислорода [19], являющиеся индукторами НЕТоза. Как следствие этого, образуется порочный круг, при котором начальная гипоксия, вызванная неправильной структурой спиральных артерий, и связанный с ней окислительный стресс индуцируют нейтрофилы для образования ловушек, наличие которых усугубляет нарушение плацентарного кровотока, увеличивая степень гипоксии и окислительного стресса [5, 20–23].
Для тяжелой преэклампсии характерно быстрое прогрессирование клинических симптомов с развитием таких осложнений, как задержка внутриутробного развития плода (8–20 %) [24], преждевременная отслойка плаценты [25], эклампсия (8 %) [26], HELLP-синдром (4–12 %) [27]. В структуре материнской смертности данное осложнение находится на четвертом месте [24]. Преэклампсия становится причиной более 70 000 материнских и 500 000 внутриутробных/неонатальных смертей ежегодно в мире [28]. В случае манифестации тяжелой преэклампсии изолированной тромбоцитопенией необходима своевременная диагностика и исключение других видов тромбоцитопений, прежде всего гестационной, как наиболее часто встречающейся.
В настоящее время диагноз тяжелой преэклампсии выставляется на основании развернутой клинико-лабораторной картины. Однако атипичная манифестация состояния может снизить настороженность в отношении преэклампсии, склоняя врача к диагнозу гестационной тромбоцитопении. Данная позиция способна привести к неправильной тактике ведения пациенток и развитию тяжелых осложнений преэклампсии. Но даже при настороженности врача подтверждение или исключение диагноза преэклампсии на ранних ее стадиях без выраженной клинической картины вызывает определенные трудности. Диагностические маркеры ранней преэклампсии, например, определение соотношения sflt-1/plgf, малодоступны в обычной клинической практике [29]. Гипердиагностика данного осложнения влечет за собой необоснованную полипрагмазию и излишние вмешательства, в том числе преждевременное родоразрешение, в которых нет необходимости при гестационной тромбоцитопении. С другой стороны, четких диагностических критериев гестационной тромбоцитопении в настоящее время также нет, диагноз гестационной тромбоцитопении является диагнозом исключения. Гестационная тромбоцитопения имеет физиологическую природу, обычно не сопровождается нарушениями коагуляции, не требует каких-либо вмешательств и проходит самостоятельно после родоразрешения [30, 31].
Таким образом, в настоящее время не существует доступного скинингового метода дифференциальной диагностики начальных проявлений тяжелой преэклампсии с другими состояниями, сопровождающимися тромбоцитопенией, в том числе гестационной.
Цель исследования — оценка возможности метода определения уровня НВЛ при проведении дифференциального диагноза между преэклампсией и гестационной тромбоцитопенией.
Сравнительное проспективное клиническое исследование уровня НВЛ в венозной крови пациенток с тяжелой преэклампсией, гестационной тромбоцитопенией и здоровых беременных было проведено на базе ГБУЗ МО «Видновский перинатальный центр» (рис. 1). Для проведения исследования формировались три группы пациенток. Объем выборки определялся табличным методом по методике К.А. Отдельновой [32]. Набор пациенток проводился без рандомизации до достижения рассчитанного объема. Пациентки распределялись в группы после подтверждения диагнозов тяжелой преэклампсии, гестационной тромбоцитопении или их исключения. В группу № 1 вошли 45 пациенток с диагнозом «тяжелая преэклампсия», установленным по следующим критериям: диастолическое АД более или равно 110 мм рт. ст., систолическое АД ≥ 160 мм рт. ст., суточная протеинурия превышает 5 г/л и/или наличие одного или нескольких дополнительных критериев тяжелой преэклампсии (HELLP-синдром, устойчивые головные боли, рвота, другие церебральные или зрительные расстройства, нарушение функции почек, острое повреждение легких, отек легких, отек зрительного нерва, нарушение функции печени, боли в эпигастрии/правом верхнем квадранте живота, тромбоцитопения и/или ее прогрессирование, внезапно появившиеся/прогрессирующие отеки, подтверждение страдания плода) [33]. Группа № 2 включала в себя 44 пациентки с диагнозом «гестационная тромбоцитопения», установленным по следующим критериям: снижение количества тромбоцитов во время данной беременности ниже 150 × 109/л, отсутствие диагноза тромбоцитопении любого генеза до настоящей беременности [34]. Контрольную группу № 3 составили 44 пациентки без преэклампсии и тромбоцитопении. Общими для всех групп критериями исключения являлись заболевания, которые согласно опубликованным данным могут сопровождаться повышением уровня НВЛ: онкологические заболевания в анамнезе или на момент исследования, сифилис в анамнезе или на момент исследования, наследственная тромбофилия (мутация V фактора (мутация Лейдена), мутация гена протромбина, дисфибриногенемия, мутация генов протеинов С и S), установленная с помощью генетических скрининговых методов до настоящей беременности, если пациентка не имела данного диагноза и не обследовалась на его наличие, то считалась свободной от данного признака; хронические инфекционные заболевания в стадии обострения, антифосфолипидный синдром, диагностированный до наступления настоящей беременности на основании Австралийских критериев 2006 г., если пациентка не имела данного диагноза и не обследовалась на его наличие, то считалась свободной от данного признака; системная красная волчанка, муковисцидоз, сепсис, ревматоидный артрит, геморрагический васкулит [3, 6–14]. Также в процессе исследования из выборки были исключены пациентки с отрицательным резус-фактором крови, многоплодной беременностью и гестационным сахарным диабетом, требующим применения инсулинотерапии. При анализе полученных данных у данной категории пациенток выявлено значимое увеличение уровня НВЛ, что требует отдельного более глубокого изучения (см. рис. 1).
Рис. 1. Схема проведения сравнительного проспективного клинического исследования «Подсчет и сравнение уровня НВЛ в венозной крови пациенток с тяжелой преэклампсией, гестационной тромбоцитопенией и здоровых беременных»
Fig. 1. Flow diagram of comparative prospective clinical study “Calculation and comparison of the level of NETs in the venous blood of patients with severe preeclampsia, gestational thrombocytopenia and healthy pregnant women”
С целью количественной оценки уровня НВЛ проводился забор венозной крови пациенток во II–III триместрах беременности в пробирки для общего анализа крови RusTech и PUTH с КЗ ЭТДА. В дальнейшем в течение 1,5 ч с момента забора изготовлялся мазок крови с плотным монослоем клеток и проводилось исследование в соответствии с методикой, описанной в патенте РФ № 2121297 «Способ определения относительного количества этотически трансформированных фагоцитов» с использованием устройства для изготовления мазка (ООО «Медтехнопарк»). Способ заключается в проведении концом размазывающей поверхности пластины по рабочей поверхности рабочего стекла, на которую наносится мазок, при этом мазок крови изготавливают равномерным по толщине в один слой эритроцитов с плотностью эритроцитов в нем 4–15 тыс./мм. Для этого использовали 2 мкл забранной крови, полученные мазки окрашивали по Романовскому—Гимзе. Подсчет НВЛ в мазке, образованных НЕТоз-трансформированным фагоцитами крови, проводился с использованием комплекса автоматизированной микроскопии МЕКОС-Ц2 (ЗАО «МЕКОС) и синтетического иммерсионного масло (ООО «Минимед»).
Во всех изготовленных мазках подсчитывалось количество нативных фагоцитов (Nнат) и разрушенных трансформированных фагоцитов (Npaзр), визуализируемых на мазке как НВЛ, уровень НВЛ вычисляли по формуле:
Уровень НВЛ = Npазруш/(Nнат + Npазруш) (%).
Все анализируемые данные были проверены на нормальность распределения. В случае их соответствия нормальному распределению для описания использованы параметрические критерии: среднее значение и стандартное отклонение. Для сравнительного анализа исследуемых групп в этом случае применялся дисперсионный анализ и t-критерий Стьюдента. Если распределение данных не соответствовало нормальному, для описания использовались медиана (М), первый и третий квартили (Q1–Q3), а для проведения сравнительного анализа критерии Краскела—Уоллеса и U-тест Манна—Уитни. Для анализа качественных признаков применялся критерий χ2 Пирсона. Различия считали достоверными при уровне критерия значимости менее 0,05. Статистический анализ результатов исследования проведен с использованием программы Statistica 10 (StatSoftInc., США).
Проведение данного исследования было одобрено этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского», г. Москва (протокол № 2/20/3 от 10.06.2020).
При анализе возрастных и весо-ростовых показателей (табл. 1) различий в исследуемых группах не выявлено. Срок гестации при проведении исследования (см. табл. 1) был значимо меньше в группе № 1, чем в группе № 2 (р = 0,000001, U-критерий Манна—Уитни) и в группе № 3 (р = 0,0002, U-критерий Манна—Уитни). Данное различие объясняется частой необходимостью преждевременного родоразрешения у пациенток с тяжелой преэклампсией. Различий в сроках беременности при проведении исследования в группах № 2 и № 3 не выявлено (U-критерий Манна—Уитни р > 0,05). Более частая встречаемость преэклампсии у первобеременных женщин [35–37] объясняет преобладание в группе № 1 первородящих пациенток по сравнению с группой № 2 (р = 0,006, U-критерий Манна—Уитни) и с группой № 3 (р = 0,006, U-критерий Манна—Уитни) (см. табл. 1). Значимых различий между группами № 2 и № 3 не выявлено (U-критерий Манна—Уитни, р > 0,05).
Таблица 1. Характеристика исследуемых групп
Table 1. Characteristics of the studied groups
| Показатель Indicator |
Группа № 1 Group 1 |
Группа № 2 Group 2 |
Группа № 3 Group 3 |
|---|---|---|---|
| Возраст, Me (Q1–Q3), лет Age, Me (Q1–Q3), years |
31 (23–37) | 30 (27–31,5) | 31 (25–35) |
| Индекс массы тела, Me (Q1–Q3) Body Mass Index, Me (Q1–Q3) |
30,2 (25,4–35,9) | 27,9 (25,6–29,5) | 28,3 (26,3–29,6) |
| Срок беременности, Me (Q1–Q3), недель Gestation period, Me (Q1–Q3), weeks |
36,3 (30–38)* | 39 (37,5–39,2) | 39 (38–39,6) |
| Паритет родов, Me (Q1–Q3) Birth parity, Me (Q1–Q3) |
1 (1–2)* | 2 (1–2,25) | 2 (1–2,75) |
| * р < 0,05 по сравнению с двумя другими группами, U-критерий Манна—Уитни. | |||
Среди сопутствующей патологии у пациенток преобладали заболевания мочеполовой системы, заболевания эндокринной системы и нарушение жирового обмена, анемия 1-й степени. Большое количество заболеваний эндокринной системы и нарушение жирового обмена в группе № 1, составляющие 40,3 % от общего числа заболеваемости, обусловлено увеличением риска развития преэклампсии у пациенток с нарушением жирового обмена [35–37]. За счет данных результатов связь между факторным и результативным признаками статистически значима при уровне значимости р < 0,01. Более подробно структура сопутствующей патологии в исследуемых группах представлена в табл. 2.
Таблица 2. Характер и частота сопутствующей патологии в группах сравнения
Table 2. Analysis of the nature and frequency of concomitant pathology in comparison groups
| Нозология Nosology |
Группа № 1 Group 1 n = 45 |
Группа № 2 Group 2 n = 44 |
Группа № 3 Group 3 n = 44 |
р, критерий χ2 Пирсона p, Chi-square test |
|---|---|---|---|---|
| Анемия 1-й степени Anemia of the 1st degree |
6 (9 %) | 8 (25,8 %) | 6 (15 %) | р < 0,001 |
| Варикозное расширение крупных вен Varicose veins of large veins |
8 (11,9 %) | 3 (9,7 %) | 3 (7,5 %) | |
| Заболевания ЖКТ Diseases of the gastrointestinal tract |
3 (4,5 %) | 7(22,5 %) | 3 (7,5 %) | |
| Заболевания опорно-двигательного аппарата Diseases of the musculoskeletal system |
0 | 0 | 2(5 %) | |
| Заболевания сердечно-сосудистой системы Diseases of the cardiovascular system |
6 (9 %) | 1 (3,3 %) | 6 (15 %) | |
| Заболевания дыхательной системы Diseases of the respiratory system |
2 (2,9 %) | 0 | 2(5 %) | |
| Заболевания эндокринной системы и нарушение жирового обмена Diseases of the endocrine system and violation of fat metabolism |
27(40,3 %) | 7 (22,5 %) | 5 (12,5 %) | |
| Неврологические заболевания Diseases of the nervous system |
3 (4,5 %) | 0 | 2 (5 %) | |
| Заболевания мочевыделительной и половой систем Diseases of the urinary-excretory and reproductive systems |
12 (17,9 %) | 5 (16,2 %) | 11 (27,5 %) |
Отличия в количестве участников в группах и сопутствующей патологии обусловлены наличием нескольких сопутствующих заболеваний у некоторых пациенток.
Выявленные групповые различия по характеру и частоте сопутствующей патологии закономерны, поскольку заболевания эндокринной системы, нарушения жирового обмена являются факторами риска развития преэклампсии [34–36] и не могли повлиять на результаты исследования.
Характеристика количества НВЛ в исследуемых группах представлена в табл. 3.
Таблица 3. Характеристики показателей количества НВЛ в исследуемых группах
Table 3. Characteristics of the indicators of the number of NETs in the studied groups
| Среднее значение Average value |
Минимум Minimum |
Максимум Maximum |
Стандартное отклонение Standard deviation |
|
|---|---|---|---|---|
| Группа № 1 Group 1 (n = 45), % |
15,3* | 5,8 | 28,7 | 5,7 |
| Группа № 2 Group 2 (n = 44), % |
7,2 | 0,9 | 13,4 | 3,2 |
| Группа № 3 Group 3 (n = 44), % |
7,7 | 1 | 13,7 | 3,2 |
| * p < 0,05 (t-критерий Стьюдента) по сравнению с группой № 2 и группой № 3. | ||||
При проведении дисперсионного анализа количества НВЛ выявлены значимые межгрупповые различия (р = 0,0003). При попарном сравнении групп с использованием t-критерия Стьюдента в группе № 1 пациенток с преэклампсией количество НВЛ было значимо выше, чем в группе № 2 пациенток с гестационной тромбоцитопенией (р = 0,001). При сравнении группы преэклампсии с группой № 3 здоровых пациенток также выявлены значимые различия (р = 0,0001, t-критерий Стьюдента). Количество НВЛ в группах № 2 и № 3 не различалось (р > 0,05, t-критерий Стьюдента).
В связи с отсутствием общепризнанных нормальных популяционных значений уровня НВЛ в венозной крови беременных за норму было принято среднее показателя НЕТоза группы № 3 с учетом стандартного отклонения, которое составило 4,45–10,85 % (7,65 ± 3,2 %, Min-Max: 1–13,7 %).
Выявленное в проведенном исследовании повышение уровня НВЛ при преэклампсии подтверждает данные мировой литературы. Подобные результаты были получены Gupta et al., которые показали, что и микроволокна синцитиотрофобласта и растворимые плацентарные факторы in vitro активируют нейтрофилы для образования НВЛ. Они также выявили у ловушек способность захватывать не только объемные объекты, например, бактерии (> 2 мкм), но и очень мелкие (< 200 Нм) частицы, такие как микроволокна синцитиотрофобласта. При преэклампсии количество сетей в плаценте было значимо выше, чем в плаценте здоровых пациенток [20]. Данных отечественных исследований на эту тему в доступных источниках найдено не было.
Эпителиальная дисфункция и эндотелиоз при преэклампсии, возможно, также связаны с увеличением уровня НВЛ, что отражено в работе Saffarzadeh et al., показавшей непосредственное токсическое действие компонентов НВЛ на эндотелий [38].
Прокоагулянтный эффект ловушек, доказанный многими авторами [39, 40], объясняет возникновение тромбоцитопении при преэклампсии, которая в первую очередь является тромбоцитопенией потребления и может предшествовать развернутой клинико-лабораторной картине преэклампсии.
С другой стороны, отсутствие различий в количестве НВЛ у пациенток с гестационной тромбоцитопенией и в контрольной группе еще раз указывает на возможный физиологический характер первой, отсутствие выраженного поражения эндотелия при данном состоянии и массивной тромбоцитопении потребления по сравнению с тромбоцитопенией при преэклампсии.
Однако недостаточная изученность данного вопроса требует проведения более масштабных исследований с целью определения референсных значений уровня НВЛ у здоровых беременных с учетом сроков гестации: при различной патологии беременности и сравнение их уровня с небеременными здоровыми исследуемыми.
Проведенный сравнительный анализ не выявил различий уровня НВЛ у здоровых беременных и пациенток с гестационной тромбоцитопенией.
Значимое повышение уровня НВЛ при развитии преэклампсии требует дальнейшего изучения возможности метода подсчета уровня НВЛ для ранней диагностики этого осложнения у пациенток высокого риска.
Значимые различия в уровне НВЛ при преэклампсии и гестационной тромбоцитопении позволяют использовать метод для дифференциальной диагностики данных заболеваний.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Disclosure. The authors declare that they have no competing interests.
Вклад авторов. Кузина Н.Б., Плахотина Е.Н., Кузовлев А.Н., Белоусова Т.Н., Брянцев Е.В., Касина Д.В. — разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.
Author contribution. Kuzina N.B., Plakhotina E.N., Kuzovlev A.N., Belousova T.N., Bryantsev E.V., Kasina D.V. — all authors according to the ICMJE criteria participated in the development of the concept of the article, obtaining and analyzing factual data, writing and editing the text of the article, checking and approving the text of the article.