Введение
Во время кардиохирургических операций с применением искусственного кровообращения (ИК) и циркуляторного ареста (ЦА) возникают ишемически-реперфузионные повреждения. Интестинальная ишемия-реперфузия может вызывать системную воспалительную реакцию с последующим развитием сепсиса и полиорганной недостаточности. Еще в 1960-х годах Файном и его коллегами была выдвинута теория о том, что кишечная гипоперфузия приводит к транслокации эндотоксина, который является кишечно-опосредованным фактором, способствующим развитию сепсиса [1]. На сегодняшний день считается, что желудочно-кишечная гипоперфузия играет ключевую роль в инициировании и/или сохранении критического состояния у больного. Одну из ключевых ролей в инициации ишемически-реперфузионного повреждения играет ИК, которое ассоциировано с кишечной гипоперфузией, системным воспалением, микроциркуляторными нарушениями, снижением барьерной функции слизистой кишечника и гемолизом, что в совокупности может приводить к полиорганной недостаточности [1]. Поэтому в кардиохирургии крайне актуальна проблема защиты интестинальных органов, для того чтобы предупредить и снизить риски сепсиса и полиорганной недостаточности. Уникальные плейотропные эффекты молекулы оксида азота (NO) остаются в центре оживленной полемики. NO участвует в модуляции тонуса гладкой мускулатуры, регуляции секреции кислоты и желудочной слизи, поддержании кровотока слизистой оболочки желудка и кишечника [2, 3]. NO поддерживает вазодилатацию, регулирует кровоток и контролирует базальное артериальное давление. Синтезируясь и поглощаясь эритроцитами, NO оказывает влияние на деформируемость эритроцитов, стабилизируя их архитектонику [4]. Истощение запасов NO в организме приводит к системным нарушениям [3–5]. Последствием применения ИК является развитие внутрисосудистого гемолиза с повышением уровня свободного гемоглобина (fHb), который удаляет NO из сосудистого депо [6]. В результате снижается микроциркуляторная биодоступность NO, нарушается деформируемость эритроцитов, как следствие, возникает нарушение доставки кислорода и питательных веществ через микрососудистое русло, это, в свою очередь, приводит к гипоперфузии органов, ухудшению реологии крови и кислотно-основного состояния [4, 7]. Именно этим механизмом ученые объясняют развитие дистонии гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта, васкулопатии, эндотелиальной дисфункции, повреждения почек, легочной гипертензии, повышенного артериального давления и повышения смертности у пациентов с сепсисом. Таким образом, системный и локальный метаболизм NO — фундаментальный фактор поддержания нормальной оксигенации и метаболизма тканей [4]. В многочисленных опытах уже было доказано, что во время ишемии-реперфузии и гемолиза именно дефицит NO коррелировал с кишечными и почечными повреждениями [4]. Поэтому в эксперименте на животных с моделированием ИК и ЦА мы хотели оценить влияние экзогенного NO на степень повреждения ткани кишечника и деформируемость эритроцитов, проследить связь между ишемически-реперфузионным повреждением кишечника и повреждением мембран эритроцитов. Возможно, что экзогенный NO может снижать нарушения метаболического тканевого гомеостаза, улучшать деформируемость эритроцитов, улучшать кровоток и снижать степень повреждения кишечника во время ишемии-реперфузии.
Цель исследования
Изучить влияние экзогенного оксида азота на степень повреждения ткани кишечника и мембран эритроцитов при моделировании искусственного кровообращения и циркуляторного ареста в эксперименте.
Материалы и методы
Было проведено одноцентровое проспективное рандомизированное экспериментальное исследование влияния оксида азота на кишечник и структурную организацию мембран эритроцитов в условиях моделирования ИК и ИК+ЦА. Все болезненные процедуры и выведение животных из эксперимента осуществлялись во время хирургической стадии наркоза, исследование было выполнено в соответствии с международными стандартами гуманного обращения с животными и директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, а также согласно приказу Минздрава от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Эксперимент проводили на базе лаборатории медицины критических состояний после одобрения локальным этическим комитетом по биомедицинской этике НИИ кардиологии Томского НИМЦ (утверждение № 230 от 28 июня 2022 г.).
В эксперименте участвовали бараны алтайской породы, которые находились в условиях конвенционального вивария, массой 30,58 ± 2,84 кг и в возрасте 1 года, n = 24. Все бараны были сопоставимы по полу, возрасту и весу в 4 группах. Рандомизация осуществлялась методом последовательно пронумерованных непрозрачных конвертов. Для чистоты эксперимента распределение терапии NO было подготовлено независимым оператором (ассистентом-исследователем), не участвовавшим в исследовании. Участники эксперимента, аналитики данных, составители отчетов и протоколов были ослеплены. В результате все бараны были разделены на 4 группы по 6 животных: «ИК» и «ИК+NO», «ИК+ЦА» и «ИК+ЦА+NO». В группах с NO доставку осуществляли в контур аппарата искусственной вентиляции легких (ИВЛ) и в контур экстракорпоральной циркуляции с концентрацией 80 ppm. В группах без NO осуществляли стандартную методику проведения ИВЛ и ИК по протоколу, регламентированному текущими клиническими рекомендациями.
Методика проведения операции
Эксперимент во всех группах начинали с масочной индукции анестезии севофлураном. Далее для инфузионной терапии и индукции анестезии в асептических условиях выполняли катетеризацию большой подкожной вены задней конечности катетером 18 G. Перед вводной анестезией налаживали стандартный мониторинг: пульсоксиметрии и электрокардиограммы (ЭКГ). Вводную анестезию выполняли дробным введением 1% пропофола до появления признаков анестезии. На фоне спонтанного дыхания выполняли оротрахеальную интубацию эндотрахеальной трубкой № 6,5 с проводником, фиксировали трубку и начинали ИВЛ с помощью аппарата Puritan Bennett 760 (США). Баранам из групп «ИК+NO» и «ИК+ЦА+NO» доставку NO начинали сразу после интубации трахеи через контур аппарата ИВЛ с концентрацией 80 ppm. С целью поддержания анестезии выполняли инфузию пропофола 5 мг/кг/ч, с целью миорелаксации использовали пипекурония бромид 0,1 мг/кг. Далее налаживали расширенный мониторинг: ЭКГ, инвазивное измерение артериального давления, капнографию, пульсоксиметрию, диурез и термометрию с помощью мониторинговой системы Nihon Kohden Life Scope I BSM — 2301K (Nihon Kohden, Япония) с установлением термодатчика в пищевод, в группах с ЦА дополнительно устанавливали термодатчик в прямую кишку.
С целью инвазивного измерения артериального давления и забора крови для лабораторного анализа катетеризировали общую сонную артерию катетером 20 G. Для инфузионной терапии катетеризировали внутреннюю яремную вену двухпросветным катетером 7 F. Далее выполняли правостороннюю торакотомию по 4-му межреберью. ИК осуществляли с помощью аппарата искусственного кровообращения Maquet HL 20 (Maquet, Германия). Подключение аппарата искусственного кровообращения по схеме «аорта –– верхняя полая вена –– нижняя полая вена». Среднее АД (ср.АД) во время ИК поддерживали на уровне 50–70 мм рт. ст. В группах без ЦА ИК проводили в условиях нормотермии (36,0–36,6 °С). Двум группам с ЦА по достижении эзофагеальной температуры 30 °С выполняли окклюзию нисходящей аорты с сохранением перфузии верхней части тела и снижением перфузионного индекса до 1 л/мин/м2 в течение 15 мин. После истечения 15 мин снимали зажим с нисходящей аорты, осуществляли реперфузию и согревание до 36,6 °С. Общее время ИК в 4 группах составило 90 мин. Для обеспечения гипокоагуляции во время ИК использовали гепарин в дозе 3 мг/кг внутривенно с поддержанием уровня времени активированного свертывания > 450 с.
Через 1 ч после отлучения от ИК на фоне спонтанного кровообращения и хирургической стадии наркоза был выполнен забор ткани кишечника для морфологического и морфометрического исследования. Все бараны дошли до заключительного этапа без преждевременных летальных исходов и были гуманно выведены из эксперимента на фоне хирургической стадии наркоза.
Методика доставки оксида азота
Во время эксперимента для доставки и мониторинга NO/NO2 использовали аппарат для терапии оксидом азота АИТ-NO-01 (ТИАНОКС).
В группе «ИК+NO» доставку NO начинали после интубации трахеи в контур аппарата ИВЛ, далее после начала ИК продолжали доставку в контур экстракорпоральной циркуляции в течение 90 мин, после отлучения от ИК и перевода на спонтанное кровообращение в течение 1 ч подачу продолжали вновь в контур аппарата ИВЛ с концентрацией 80 ppm.
В группе «ИК+ЦА+NO» доставку NO начинали после интубации трахеи в контур аппарата ИВЛ, далее после начала ИК продолжали доставку в контур экстракорпоральной циркуляции до начала гипотермического ЦА. Во время ЦА (на протяжении 15 мин) доставку NO прекращали. После завершения ЦА возобновляли доставку NO в контур аппарата искусственного кровообращения (общая продолжительность ИК и ЦА составила 90 мин). Далее после отлучения от ИК и перевода на спонтанное кровообращение подачу NO продолжали вновь в контур аппарата ИВЛ с концентрацией 80 ppm в течение 1 ч.
На протяжении всего периода эксперимента концентрация NO в группах «ИК+NO» и «ИК+ЦА+NO» была 80 ppm. Максимально допустимой концентрацией вдыхаемого NO2 в группах «ИК+NO» и «ИК+ЦА+NO» считали 2 ppm.
Методика определения эффективности NO терапии и адекватности механической перфузии
Во время эксперимента для оценки эффективности терапии NO и безопасности проведения эксперимента во всех группах на этапах до начала ИК, начала ИК, после отлучения от ИК оценивали: кислотно-основное состояние, газовый состав крови, гематокрит, концентрацию электролитов, лактата, глюкозы, гемоглобина, свободного гемоглобина, метгемоглобина.
Для оценки структурной организации мембран эритроцитов определяли показатели коэффициентов микровязкости и полярности мембран эритроцитов в области липид-липидных (КМЛЛК, КПЛЛК соответственно) и белок-липидных контактов (КМБЛК, КПБЛК соответственно). Во всех группах по окончании эксперимента проводили забор материала с последующим морфологическим исследованием ткани тонкой кишки животных для оценки выраженности ишемически-реперфузионного повреждения кишечника во время моделирования ИК и ЦА.
Методика определения коэффициентов микровязкости и полярности мембран эритроцитов
Для определения коэффициентов микровязкости и полярности мембран эритроцитов производили забор венозной крови на этапах до начала ИК и после отлучения от ИК.
Кровь набирали в вакутейнеры, содержащие напыленный на стенки гепарин лития (17 МЕ/мл). Образцы крови центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. После удаления плазмы эритроцитарный осадок 3 раза отмывали охлажденным физиологическим раствором, каждый раз эритроциты осаждали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Мембраны эритроцитов получали путем гипоосмотического гемолиза. Количество общего белка в суспензии теней эритроцитов определяли методом микро-Лоури в модификации Оhnishi S.T. с использованием реактивов фирмы Sigma. Для определения спектральных характеристик образец мембран эритроцитов разводили в 10 мМ трис-HCl буфере (рН = 7,4) до конечной концентрации белка 0,3 мг/мл.
Определяли спектральные характеристики взаимодействия мембран с флуоресцентным зондом пирен (Sigma) на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США). К 2 мл суспензии мембран эритроцитов добавляли 20 мкл 10 мкМ спиртового раствора зонда пирен. Микровязкостные свойства мембран в области аннулярных и общих липидов оценивали по степени эксимеризации пирена, вычисляя отношение интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров (J470/J370) при длине волны возбуждающего света (λв) соответственно 285 и 340 нм. Полярность анализировали по отношению амплитуд вибрационных пиков эксимеров и мономеров (J390/J370) при длинах волн возбуждающего света λв = 285 и λв = 340 нм.
Методика проведения морфологического и морфометрического исследования ткани тонкой кишки
Через 1 ч после отлучения от ИК осуществляли забор ткани тонкой кишки для последующего морфологического исследования, после чего на фоне хирургической стадии наркоза животных выводили из эксперимента. Для равномерной фиксации фрагмент тонкой кишки иссекали плоской формы размером 1–2 см на 3–5 мм. После забора материала его помещали в емкость с фиксатором — 10 % нейтральным формалином. Гистосрезы готовили на ротационном автоматическом микротоме (HM 355S Thermo Scientific, США) толщиной 5–7 мкм. Депарафинированные гистологические срезы органов для оценки морфологической картины окрашивали по общепринятой методике гематоксилином и эозином для получения обзорных препаратов. Микропрепараты исследовали с помощью светового микроскопа Axioscope 40 (Zeiss, Германия). С помощью программы ImageJ 1.52 подсчитывали комплекс морфометрических показателей: высоту ворсинок тонкого кишечника, высоту энтероцитов ворсинок, а также количество интраэпителиальных лимфоцитов (ИЭЛ) на 100 эпителиальных клеток в ворсинке.
Статистический анализ
Статистический анализ полученных результатов выполняли в программе STATISTICA 12, версия 12.0.0.0. Проверка согласия с нормальным законом проводилась с помощью критерия Шапиро—Уилка. Использовали среднее значение (M) и стандартное отклонение (SD) при нормальном распределении или Me (Q25; Q75) при распределении, отличном от нормального. Для выявления статистически значимых различий количественных показателей в зависимых и независимых группах использовался критерий Стьюдента при нормальном распределении или U-тест Манна—Уитни и Т-критерий Уилкоксона при распределении, отличном от нормального. Все результаты статистического анализа считались статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.
Результаты исследования
Между группами экспериментальных животных «ИК» и «ИК+NO», «ИК+ЦА» и «ИК+ЦА+NO» была проанализирована динамика основных показателей гомеостаза и адекватности механической перфузии в организме животных. Был проведен анализ межгрупповых и внутригрупповых различий показателей на этапах эксперимента до начала ИК, в момент начала ИК и после отлучения от ИК. Данные представлены в табл. 1.
| Основные показатели гомеостаза в группах «ИК» и «ИК+NO» | ||||
|---|---|---|---|---|
| Показатели | Этапы эксперимента | Группа «ИК», n = 6 |
Группа «ИК+NO», n = 6 |
р |
| fHb, г/л | До начала ИК | 6,50 ± 2,07 | 6,17 ± 2,79 | 0,819 |
| Начало ИК | 8,00 ± 3,69 | 7,67 ± 2,73 | 0,862 | |
| После отлучения от ИК | 47,50 ± 6,44 | 49,50 ± 4,18 | 0,538 | |
| Лактат, ммоль/л | До начала ИК | 2,15 ± 0,58 | 1,52 ± 0,67 | 0,209 |
| Начало ИК | 3,30 ± 0,53 | 2,05 ± 0,72 | 0,032 | |
| После отлучения от ИК | 5,97 ± 1,45 | 3,32 ± 2,08 | 0,082 | |
| Hb, г/л | До начала ИК | 98,50 ± 4,65 | 97,25 ± 8,84 | 0,811 |
| Начало ИК | 76,50 ± 6,13 | 78,75 ± 4,11 | 0,564 | |
| После отлучения от ИК | 84,50 ± 5,45 | 94,25 ± 6,99 | 0,070 | |
| Ht, % | До начала ИК | 28,25 ± 1,71 | 27,75 ± 2,63 | 0,761 |
| Начало ИК | 20,50 ± 2,64 | 21,75 ± 1,71 | 0,457 | |
| После отлучения от ИК | 22,50 ± 1,29 | 24,75 ± 2,06 | 0,113 | |
| ср.АД, мм рт. ст. | До начала ИК | 112,25 ± 8,26 | 110,50 ± 6,65 | 0,752 |
| Начало ИК | 58,25 ± 4,78 | 65,25 ± 5,25 | 0,096 | |
| После отлучения от ИК | 82,50 ± 7,50 | 84,50 ± 5,32 | 0,678 | |
| Основные показатели гомеостаза в группах «ИК+ЦА» и «ИК+ЦА+NO» | ||||
| Показатели | Этапы эксперимента | Группа «ИК+ЦА», n = 6 |
Группа «ИК+ЦА+NO», n = 6 |
р |
| fHb, г/л | До начала ИК | 7,00 ± 2,09 | 5,83 ± 1,17 | 0,262 |
| Начало ИК | 7,17 ± 1,72 | 6,33 ± 1,63 | 0,409 | |
| После отлучения от ИК | 44,50 ± 4,64 | 42,50 ± 4,46 | 0,464 | |
| Лактат, ммоль/л | До начала ИК | 1,47 ± 0,62 | 1,30 ± 0,48 | 0,674 |
| Начало ИК | 3,47 ± 1,07 | 3,35 ± 0,63 | 0,847 | |
| После отлучения от ИК | 6,62 ± 0,94 | 5,37 ± 0,80 | 0,091 | |
| Hb, г/л | До начала ИК | 97,25 ± 8,30 | 96,25 ± 5,90 | 0,851 |
| Начало ИК | 76,50 ± 8,58 | 82,75 ± 9,74 | 0,372 | |
| После отлучения от ИК | 88,75 ± 5,96 | 92,00 ± 5,35 | 0,448 | |
| Ht, % | До начала ИК | 27,00 ± 2,58 | 27,00 ± 2,45 | 1,000 |
| Начало ИК | 19,50 ± 1,73 | 21,00 ± 2,44 | 0,355 | |
| После отлучения от ИК | 23,75 ± 2,50 | 25,00 ± 1,82 | 0,450 | |
| ср.АД, мм рт. ст. | До начала ИК | 108,50 ± 11,15 | 113,00 ± 10,73 | 0,582 |
| Начало ИК | 59,00 ± 7,74 | 58,75 ± 6,23 | 0,961 | |
| После отлучения от ИК | 82,75 ± 10,93 | 85,25 ± 9,42 | 0,740 | |
Во время эксперимента у животных во всех четырех группах показатели кислотно-основного состояния, газового состава крови, концентрации электролитов находились в референсных значениях и не различались между группами на всех этапах. Также в течение всего периода эксперимента на разных этапах происходило закономерное изменение показателей свободного гемоглобина, лактата, гемоглобина, гематокрита, а также системной гемодинамики. Данные показатели были в референсных значениях и не отличались на этапах между группами, что свидетельствует о стабильном состоянии гомеостаза, адекватности механической перфузии и безопасности процедуры доставки NO. Более того, концентрация лактата в группе «ИК+NO» на этапе начало ИК была статистически значимо ниже, чем в группе «ИК», р = 0,032 (см. табл. 1).
В табл. 2 представлены данные динамики показателей КМЛЛК, КПЛЛК, КМБЛК; КПБЛК мембран эритроцитов в четырех группах на этапах до начала ИК и после отлучения от ИК.
| Коэффициент микровязкости и полярности мембран эритроцитов на этапах наблюдения в группах «ИК» и «ИК+NO» | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Показатели | Этапы эксперимента | Группа «ИК», n = 6 |
p (между этапами до начала и после отлучения от ИК) | Группа «ИК+NO», n = 6 |
p (между этапами до начала и после отлучения от ИК) | p (между группами) |
| КМЛЛК | До начала ИК | 0,29 (0,19; 0,34) | 0,753 | 0,26 (0,14; 0,38) | 0,753 | 0,689 |
| После отлучения от ИК | 0,24 (0,19; 0,39) | 0,25 (0,25; 0,26) | 0,810 | |||
| КМБЛК | До начала ИК | 0,38 (0,33; 0,49) | 0,028 | 0,41 (0,39; 0,43) | 0,753 | 0,810 |
| После отлучения от ИК | 0,16 (0,15; 0,22) | 0,38 (0,25; 0,46) | 0,013 | |||
| КПЛЛК | До начала ИК | 1,05 (1,04; 1,05) | 0,753 | 1,03 (1,04; 1,04) | 0,600 | 0,066 |
| После отлучения от ИК | 1,05 (1,04; 1,06) | 1,04 (1,04; 1,06) | 0,810 | |||
| КПБЛК | До начала ИК | 5,08 (4,32; 5,91) | 0,046 | 5,01 (4,77; 5,85) | 0,753 | 0,936 |
| После отлучения от ИК | 3,17 (3,09; 4,12) | 4,89 (4,77; 5,16) | 0,005 | |||
| Коэффициент микровязкости и полярности мембран эритроцитов на этапах наблюдения в группах «ИК+ЦА» и «ИК+ЦА+NO» | ||||||
| Показатели | Этапы эксперимента | Группа «ИК+ЦА», n = 6 |
p (между этапами до начала и после отлучения от ИК) | Группа «ИК+ЦА+NO», n = 6 |
p (между этапами до начала и после отлучения от ИК) | p (между группами) |
| КМЛЛК | До начала ИК | 0,31 (0,22; 0,35) | 0,683 | 0,30 (0,28; 0,37) | 0,221 | 0,936 |
| После отлучения от ИК | 0,26 (0,24; 0,33) | 0,26 (0,25; 0,27) | 0,810 | |||
| КМБЛК | До начала ИК | 0,40 (0,34; 0,45) | 0,040 | 0,40 (0,31; 0,42) | 0,683 | 0,810 |
| После отлучения от ИК | 0,25 (0,23; 0,27) | 0,39 (0,35; 0,43) | 0,020 | |||
| КПЛЛК | До начала ИК | 1,04 (1,03; 1,01) | 0,682 | 1,03 (1,03; 1,07) | 0,683 | 0,810 |
| После отлучения от ИК | 1,05 (1,04; 1,06) | 1,04 (1,04; 1,06) | 0,689 | |||
| КПБЛК | До начала ИК | 4,50 (3,77; 5,73) | 0,041 | 4,34 (3,86; 5,53) | 0,220 | 0,810 |
| После отлучения от ИК | 3,02 (2,36; 3,27) | 4,50 (4,02; 5,16) | 0,005 | |||
Показатели КМЛЛК и КПЛЛК не имели статистически значимых различий на этапах до начала ИК и после отлучения от ИК как внутри групп, так и между группами.
При анализе показателя КМБЛК в группе «ИК» на этапе после отлучения от ИК было выявлено снижение этого показателя от исходного значения, p = 0,028. В группе «ИК+NO» не отмечено изменений в показателях КМБЛК на этапах эксперимента.
При анализе показателя КПБЛК в группе «ИК» на этапе после отлучения от ИК было выявлено снижение этого показателя от исходного значения, p = 0,046. В группе «ИК+NO» не отмечено изменений уровня КПБЛК на этапах эксперимента.
Отмечено снижение КМБЛК в сравнении с исходными значениями в группе «ИК+ЦА» на этапе после отлучения от ИК, p = 0,04. В группе «ИК+ЦА+NO» не выявлено изменений в показателе КМБЛК.
Отмечено снижение КПБЛК в сравнении с исходными значениями в группе «ИК+ЦА» на этапе после отлучения от ИК, p = 0,041. В группе «ИК+ЦА+NO» не выявлено изменений в показателях КПБЛК на этапах эксперимента.
При микроскопической оценке структуры стенки тонкой кишки у экспериментальных животных в группах «ИК» и «ИК+ЦА» были найдены признаки повреждения клеточных структур.
В группе «ИК» выражен общий отек всех оболочек тонкой кишки. Выраженная гиперемия капилляров кишечных ворсинок, подслизистых и межмышечных нервных сплетений, венозное полнокровие сосудов подслизистой оболочки (рис. 1, А).
В группе «ИК+NO» все оболочки тонкой кишки имеют обычный вид. Центральный лимфатический капилляр кишечных ворсинок во всех отделах кишки расширен в верхней трети, из-за чего сами кишечные ворсинки имеют булавообразный вид. Заметна умеренная гиперемия сосудов подслизистой оболочки (рис. 1, Б).
Рис. 1. Гистологические картины фрагментов тонкой кишки (×200, ×50), окраска гематоксилином и эозином в группах: А — «ИК»; Б — «ИК+NO» Fig. 1. Histological images of the small intestine fragments (×200, ×50), hematoxylin and eosin staining: А — in the “CPB” group; Б — in the “CPB+NO” group
В группе «ИК+ЦА» просвет тонкой кишки заполнен слущенными эпителиоцитами и единичными круглоядерными клетками. Кишечные ворсинки некротизированы, кишечные крипты сохранны, инфильтрированы круглоядерными клетками. Выражен общий отек всех оболочек тонкой кишки (рис. 2, А).
В группе «ИК+ЦА+NO» отмечается умеренная гиперемия сосудов подслизистой оболочки. Кишечные ворсинки некротизированы, кишечные крипты сохранны, инфильтрированы круглоядерными клетками. Выражен общий отек всех оболочек тонкой кишки (рис. 2, Б).
Рис. 2. Гистологические картины фрагментов тонкой кишки (×200, ×100, ×50), окраска гематоксилином и эозином в группах: А — «ИК+ЦА»; Б — «ИК+ЦА+NO» Fig. 2. Histological images of the small intestine fragments (×200, ×100, ×50), hematoxylin and eosin staining: А — in the “CPB+CA” group; Б — in the “CPB+CA+NO” group
Таким образом, выявлено, что в группах «ИК+NO», «ИК+ЦА+NO» признаки гипоперфузионного повреждения кишечника менее выражены, чем в группах «ИК», «ИК+ЦА».
Результаты микроскопии стенки тонкой кишки подтверждаются проведенным морфометрическим анализом данных биоптатов тонкой кишки у экспериментальных животных (табл. 3).
| Морфометрические данные биоптатов тонкого кишечника в группах «ИК» и «ИК+NO» | |||
|---|---|---|---|
| Показатели | Группа «ИК», n = 6 |
Группа «ИК+NO», n = 6 |
р |
| Высота ворсинок, мкм | 364,71 (343,78; 395,38) | 381,39 (356,64; 399,77) | 0,304 |
| Высота энтероцитов, мкм | 26,84 (24,40; 29,18) | 28,47 (26,79; 31,09) | 0,018 |
| Количество ИЭЛ на 100 эпителиальных клеток | 18,50 (14,00; 23,00) | 16,50 (14,00; 20,00) | 0,119 |
| Морфометрические данные биоптатов тонкого кишечника в группах «ИК+ЦА» и «ИК+ЦА+NO» | |||
| Показатели | Группа «ИК+ЦА», n = 6 |
Группа «ИК+ЦА+NO», n = 6 |
p |
| Высота ворсинок, мкм | 311,62 (261,13; 340,77) | 347,16 (300,50; 366,05) | 0,011 |
| Высота энтероцитов, мкм | 23,43 (18,19; 26,05) | 26,47 (24,09; 30,28) | 0,000 |
| Количество ИЭЛ на 100 эпителиальных клеток | 30,50 (25,00; 35,00) | 23,00 (18,00; 27,00) | 0,000 |
| Морфометрические данные биоптатов тонкого кишечника в группах «ИК» и «ИК+ЦА» | |||
| Показатели | Группа «ИК», n = 6 |
Группа «ИК+ЦА», n = 6 |
р |
| Высота ворсинок, мкм | 364,71 (343,78; 395,38) | 311,62 (261,13; 340,77) | 0,000 |
| Высота энтероцитов, мкм | 26,84 (24,40; 29,18) | 23,43 (18,19; 26,05) | 0,001 |
| Количество ИЭЛ на 100 эпителиальных клеток | 18,50 (14,00; 23,00) | 30,50 (25,00; 35,00) | 0,000 |
Высота ворсинок в группе «ИК+ЦА» была меньше, чем в группе «ИК+ЦА+NO», р = 0,011.
Высота энтероцитов в группах «ИК» и «ИК+ЦА» была меньше, чем в группах «ИК+NO» и «ИК+ЦА+NO», р = 0,018, р = 0,0005 соответственно.
Количество ИЭЛ на 100 эпителиальных клеток в группе «ИК+ЦА» было больше, чем в группе «ИК+ЦА+NO», р = 0,0001.
Также было отмечено, что в группе «ИК+ЦА» признаки повреждения клеточных структур биоптата тонкого кишечника были статистически значимо больше, чем в группе «ИК».
Высота ворсинок в группе «ИК+ЦА» была меньше, чем в группе «ИК», р < 0,001.
Высота энтероцитов в группе «ИК+ЦА» была меньше, чем в группе «ИК», р = 0,001.
Количество ИЭЛ на 100 эпителиальных клеток в группе «ИК+ЦА» было больше, чем в группе «ИК», р < 0,001.
Обсуждение
В нашем исследовании мы оценивали влияние экзогенного NO на выраженность ишемически-реперфузионного повреждения кишечника при моделировании ИК и ИК+ЦА. На сегодняшний день NO используют не только в качестве терапии легочной гипертензии, но также активно внедряют в кардиохирургическую практику с целью защиты почек и сердца [8–10]. В литературе имеются данные о том, что доставка NO в контур ИК у детей сопровождается кардиопротективным действием, заключающимся в значимом снижении в послеоперационном периоде уровней тропонина I и натрийуретического пептида типа В. В работах других авторов подобный кардиопротективный эффект был подтвержден на взрослой популяции. Согласно работам других авторов, применение NO способно снижать высвобождение маркеров повреждения миокарда и противодействовать субклинической дисфункции левого желудочка во время и сразу после ИК. Таким образом, защита органов может быть опосредована за счет противовоспалительных свойств NO [11, 12]. В нашей работе мы сделали шаг в сторону защиты кишечника от последствий воздействия медиаторов воспаления, которые высвобождаются при ишемии-реперфузии. Так, ишемически-реперфузионные повреждения, приводящие к развитию эндотелиальной дисфункции, снижению продукции NO, повреждению эндотелия с последующим нарушением регуляции сосудистого тонуса, а также длительной вазоконстрикцией, внутрисосудистой активацией лейкоцитов и тромбоцитов, приводят не только к повреждению миокарда, но и других органов, в частности кишечника. Именно кишечник является одним из самых уязвимых органов во время гипоперфузии и ишемии-реперфузии. Важно понимание комплексного подхода при защите органов. В недавней работе была продемонстрирована связь доставляемого NO в контур ИК с улучшением тканевого метаболизма, снижением уровня лактата и повышением уровня АТФ в тканях миокарда, легких и почек [10, 13]. Наше исследование должно поспособствовать расширению знаний в области влияния NO на другие органы при различных стресс-факторах, а также показать важность взаимодействия системы эритроцит–кишечник.
В кардиохирургии такие факторы, как ИК, ЦА, гипотермия, низкий сердечный выброс, длительная потребность в вазопрессорной поддержке, продленное ИВЛ с потребностью в миорелаксации, провоцируют и/или усиливают осложнения, связанные с ишемией-реперфузией, гемолизом и гипоперфузией органов. Как уже отмечалось ранее, интестинальная гипоперфузия считается инициатором полиорганной дисфункции. Она приводит к ишемии интестинальных ворсинок и нарушению барьерной функции слизистой оболочки, в результате в системный кровоток попадают бактерии и эндотоксины [14, 15]. В результате транслокации в системный кровоток и/или во внекишечные стерильные органы возникает серьезный риск септического шока, синдрома системного воспалительного ответа и последующей полиорганной недостаточности. Как известно, эпителий кишечника — это физиологический барьер, предотвращающий микробную инвазию, а также это модулятор иммунного ответа [14–16]. NO способен положительно влиять на микроциркуляцию, а также в физиологических условиях он выступает в роли эндогенного медиатора, который участвует в модуляции восстановления целостности слизистой оболочки и тканей [1, 17]. На животных моделях кишечной ишемии-реперфузии, геморрагического шока уже была доказана связь между транслокацией бактерий кишечника и развитием сепсиса ь, что во время ИК и ЦА действительно возникают значительная ишемия и повреждение тонкой кишки, в результате чего повреждаются ворсинки и энтероциты, а также значительно увеличено, особенно в группах с ЦА, количество ИЭЛ, которые защищают слизистую от бактерий и вирусов. В норме эти клетки не превышают более 10 ИЭЛ на 100 эпителиальных клеток в ворсинке, а при воспалении стенки кишки возникает выраженное увеличение их числа. ИЭЛ при воспалительных процессах и повреждении слизистой становятся аутореактивными цитотоксическими лимфоцитами, которые секретируют воспалительные молекулы. Под действием воспалительных медиаторов ворсинки уплощаются, происходит уплощение и вакуолизация энтероцитов, возникает гиперплазия крипт с выраженными митозами в криптах. При более длительном повреждении ворсинки погибают, и слизистая утрачивает способность нормального пристеночного пищеварения, нарушается всасывание веществ, может развиваться вторичная лактозная и ферментативная недостаточность. В нашем эксперименте было установлено, что более мощное повреждение клеточных структур происходило в группах с ЦА по сравнению с группой ИК. Это доказывает, что во время ЦА кишечник в отсутствие дистальной перфузии подвержен более агрессивному воздействию и нуждается в большей защите. Также мы продемонстрировали, что в группах с NO повреждение ворсинок, энтероцитов и увеличение ИЭЛ в ткани кишечника были значительно меньше. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что экзогенный NO во время ИК, а особенно при ЦА оказывает положительное влияние на структурно-клеточное состояние ткани и слизистой кишечника. При этом полнокровие и расширенные сосуды ворсинок тонкого кишечника лишь подтверждают эффект оксида азота как вазодилататора и вещества, которое участвует в регуляции кровотока спланхнической системы.
Для того чтобы выявить возможные субклеточные механизмы влияния NO, мы оценивали показатели полярности и микровязкости мембран эритроцитов, которые характеризуют способность деформироваться. Деформируемость эритроцита — это его способность проходить через узкие капилляры микроциркуляторного русла, обеспечивая тем самым нормальное кровообращение и улучшение доставки газов к тканям [18, 19]. Деформируемость зависит от формы клетки, вязкости цитоплазмы и механических свойств мембраны. Мембрана эритроцита, как и любой другой клетки, представляет собой липидный бислой с асимметрично встроенными белками. Липидный бислой и цитоскелет эритроцитов оказывают влияние на механические свойства мембран, а вязкость и эластичность — на физические свойства скелета мембраны. Липиды мембраны обеспечивают проницаемость и нормальное функционирование всех структур за счет регуляции подвижности и активности интегральных белков. Катаболизм липидов мембран не ферментативный, поэтому повреждение и разрушение липидов происходят в реакциях перекисного окисления липидов [20]. Именно повышенное образование активных форм кислорода при превышении порога детоксицирующего защитного эффекта приводит к запуску непрекращающегося перекисного окисления липидов. Этот процесс может запускаться, в том числе ИК и гипотермическим ЦА, повреждая клетку. Активные формы кислорода проникают в толщу гидрофобного липидного слоя мембраны эритроцита и вступают в реакцию с полиненасыщенными жирными кислотами, образуя липидные радикалы, которые вступают в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом с образованием радикала липоперекиси. При повреждении антиоксидантной системы во время ишемии-реперфузии радикалы продолжают образовываться, усугубляя перекисное окисление липидов. В результате происходит деструкция липидного бислоя, повышается его микровязкость, сокращается площадь белок-липидных контактов, изменяются мембранная проницаемость и поверхностный заряд, нарушается механическое и функциональное состояние мембраны эритроцита [19, 20]. Повреждение липидно-белкового компонента мембраны приводит к нарушению деформируемости эритроцитов, снижению их способности проникать в мелкие капилляры и осуществлять диффузию газов и, как следствие, к тканевой гипоксии [18, 20]. Так как неполярные вещества способны проникать сквозь мембрану эритроцита, NO легко проникает сквозь мембрану и за счет диффузии покидает ее. Возможно, NO в условиях усиленного окислительного стресса, спровоцированного ишемией-реперфузией, может предотвращать активное образование активных форм кислорода и перекисного окисления липидов, снижая повреждение мембранных структур свободными радикалами [20, 21]. Механизм влияния NO на мембрану эритроцита представлен на рис. 3.
Рис. 3. Схема влияния оксида азота на структурную организацию мембраны эритроцита DF — the damaging factor (повреждающий фактор); NO — экзогенный оксид азота; SLIP — обозначение, митохондрия находится в гибернации и не высвобождает большой пул АФК; АФК — активные формы кислорода; ПОЛ — перекисное окисление липидов; 1 — митохондрия; 2 — кровеносный сосуд; 3 — эритроцит; 4 — мембрана эритроцита, с внешней и внутренней средой, в которых находятся разные структуры, одни из которых это липиды, а другие белки и каждые из них образуют контакты липид-липидные и белок-липидные; 5 — белки мембраны; 6 — повреждение контактов, за счет радикалов активных форм кислорода, которые активно высвобождаются при повреждающем факторе, с последующем неконтролируемом запуске ПОЛ; 7 — деформированные эритроциты. Fig. 3. Experimental design of the effect of nitric oxide on the structural organization of erythrocyte membranes DF — the damaging factor; NO — exogenous nitric oxide; SLIP — mitochondrial hibernation, a large ROS pool is not released; АФК — reactive oxygen species (ROS); ПОЛ — lipid peroxidation (LPO); 1 — mitochondria; 2 — blood vessel; 3 — erythrocyte; 4 — erythrocyte membrane with the external and internal leaflets of a different composition, consisting of lipids and proteins, which form lipid-lipid and protein-lipid interactions; 5 — membrane proteins; 6 — damage to lipid-lipid and protein-lipid interactions due to free radicals of reactive oxygen species, which are actively released at the damaging factor, with subsequent uncontrolled LPO; 7 — deformed erythrocytes.
В нашем эксперименте мы продемонстрировали, что во время ИК и ЦА деформируемость эритроцитов ухудшается, что, возможно, является одной из причин выраженных ишемически-реперфузионных повреждений кишечника у животных в нашем эксперименте. Напротив, в группах с NO эритроциты практически не подверглись структурным изменениям, что также, возможно, оказало положительное влияние на гистологическую картину ткани кишечника. Полученные нами данные также согласуются с исследованием Melek Bor-Kucukatay et al., где было показано, что NO является важным фактором механического поведения эритроцитов и выполняет регулирующую роль в нормальной деформируемости эритроцитов, улучшая перфузию органов [21, 22]. Ценность этого исследования заключается в закладывании фундамента для последующих работ, расширения области применения NO. В последнем метаанализе говорится о вариации механизмов реализации действия NO на организм в зависимости от концентрации. Дозы менее 20 ppm достаточно для улучшения оксигенации, а более высокие дозы необходимы для снижения давления в легочных артериях, ингибирования агрегации тромбоцитов и улучшения защиты органов, что в конечном итоге приводит к улучшению клинических исходов [17]. Кроме того, применение периоперационной доставки NO, согласно метаанализу, значимо снижает частоту возникновения правожелудочковой недостаточности и развития острого почечного повреждения у взрослых кардиохирургических пациентов. В нашем исследовании мы смогли доказать, что именно в концентрации 80 ppm интраоперационная доставка NO способна уменьшить повреждающее действие ИК и ЦА на ткань кишечника, а также способна нормализовать структурную организацию мембран эритроцитов.
Заключение
Проведение искусственного кровообращения и циркуляторного ареста в присутствии оксида азота сопровождается уменьшением морфологических признаков повреждения в клетках кишечника, а также положительно влияет на структурную организацию мембран эритроцитов, нормализуя их способность к деформируемости в условиях искусственного кровообращения и циркуляторного ареста.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Disclosure. The authors declare that they have no competing interests.
Вклад авторов. Все авторы в равной степени участвовали в разработке концепции статьи, получении и анализе фактических данных, написании и редактировании текста статьи, проверке и утверждении текста статьи.
Author contribution. All authors according to the ICMJE criteria participated in the development of the concept of the article, obtaining and analyzing factual data, writing and editing the text of the article, checking and approving the text of the article.
Этическое утверждение. Исследование одобрил локальный этический комитет по биомедицинской этике НИИ кардиологии Томского НИМЦ (протокол № 230 от 28.06.2022).
Ethics approval. The study was approved by biomedical ethics committee of Cardiology Research Institute, Tomsk National Research Medical Center (protocol No. 230, dated 28 June, 2022).
Информация о финансировании. Данное исследование было выполнено в рамках государственного задания (тема № 122123000017-3) под названием «Защита органов оксидом азота в сердечно-сосудистой хирургии: технологическая поддержка (устройства синтеза и доставки), механизмы реализации защитных эффектов и влияние на клинические исходы».
Funding source. This research was performed in the framework of the state assignment (theme No. 122123000017-3) entitled “Organ protection with nitric oxide in cardiovascular surgery: technological support (synthesis and delivery devices), mechanisms for implementing the protective effects and impact on clinical outcomes”.
Декларация о наличии данных. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, находятся в открытом доступе в репозитории Mendeley Data, V1, https://doi.org/10.17632/zb7r7vgdkk.1
Data Availability Statement. The data, the expected results, are publicly available at repository Mendeley Data, V1, https://doi.org/10.17632/zb7r7vgdkk.1
