Введение
Концепция персонализированной интенсивной терапии требует разработки принципиально новых инструментов прогнозирования в практике лечения септического шока. Интерес в качестве предикторов течения септического шока представляют разнообразные биомаркеры. Ряд из них могут являться не только собственно маркерами, но и значимыми факторами в патогенезе септического шока, что позволяет их рассматривать в качестве таргетных молекул для элиминации при экстракорпоральной терапии [1–6]. Подобным потенциалом обладает внеклеточная ДНК (вкДНК), являющаяся перспективным маркером и терапевтической мишенью при сепсисе [7, 8].
ВкДНК представляет собой двухцепочечные внеклеточные фрагменты хромосом и связанные с ними структурные белки и ферменты, высвобождаемые в кровоток в результате апоптоза, некроза или активной секреции клетками иммунной системы. Последний процесс представляет собой образование внеклеточных нейтрофильных ловушек (Neutrophil extracellular traps — NETs). Это антиинфекционный врожденный защитный механизм, в результате которого из нейтрофилов и некоторых других иммунных клеток выбрасываются деконденсированный хроматин и ядерные белки, образуя сетевидные структуры, улавливающие микроорганизмы и лизирующие их клеточную стенку [9, 10]. Структурной единицей NETs является нуклеосома, она состоит из нити ДНК, оплетающей комплекс специальных ядерных белков — гистонов. Гистоны необходимы для компактной пространственной организации ДНК. Гистон типа H3.1 характерен только для нейтрофилов и является маркером уровня NETs в плазме крови [11].
При сепсисе и септическом шоке происходит «перепроизводство» NETs, приводящее к дополнительному усилению гипервоспалительного ответа, повреждению эндотелия, тромбированию сосудов микроциркуляции, что напрямую способствует прогрессированию органной дисфункции [12]. Длительное повышение уровня вкДНК в кровотоке «перегружает» систему макрофагов, участвующих в ее естественной элиминации, снижая их фагоцитарную активность, что может быть одной из причин развития вторичной иммунодепрессии при сепсисе [13].
В ряде исследований продемонстрированы значительное повышение уровня вкДНК и NETs у пациентов с сепсисом, ассоциация степени этого повышения с выраженностью органной дисфункции и увеличением смертности [11]. Таким образом, при сепсисе вкДНК выступает в двойной роли: характеризует степень клеточного повреждения и интенсивность воспалительного ответа и одновременно является этиологическим агентом двух этих процессов [8]. Исследования вкДНК и NETs при сепсисе приобрели дополнительное практическое значение благодаря появлению методик экстракорпоральной терапии, направленных на их селективную элиминацию из кровотока [14, 15].
Цель исследования
Целью данного исследования была оценка роли NETs и вкДНК как независимых предикторов летальности у пациентов с септическим шоком и их корреляции с клинико-лабораторными данными и риском развития острого повреждения почек (ОПП), а также изучение потенциала NETs как мишени для методик очищения крови.
Материалы и методы
Дизайн исследования
Проспективное одноцентровое наблюдательное исследование, проведенное с августа 2023 г. по май 2024 г. в отделении интенсивной терапии ГБУЗ «ГКБ им. С.С. Юдина».
Критерии включения
- Возраст более 18 лет.
- Установленный диагноз сепсиса по критериям Sepsis-3.
- Гипотония, сохраняющаяся после проведения инфузионной терапии в объеме 30 мл/кг, требующая вазопрессорной терапии норэпинефрином в дозировке более 0,3 мкг/кг/мин.
Критерии исключения
- Неконтролируемое кровотечение или высокий риск его возникновения.
- Наличие венозного или артериального тромбоза.
- Наличие в течение последних 2 месяцев сердечно-сосудистых событий: острый инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения, тромбоэмболия легочной артерии.
- Тяжелая застойная хроническая сердечная недостаточность.
- Терминальная стадия хронической болезни почек.
- Цирроз печени в стадии декомпенсации.
- Тяжелая сочетанная или позиционная травма.
- Наличие инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека.
- Тяжелая гранулоцитопения (количество нейтрофилов периферической крови менее 500 клеток/мм3).
- Онкологическая патология на этапе нео- или адъювантной терапии.
- Постоянный прием иммуносупрессивной терапии.
В соответствии с указанными критериями в исследование было включено 52 пациента (рис. 1).
Рис. 1. Схема отбора больных для надлежащего исследования Примечание: ТХПН — терминальная хроническая почечная недостаточность; ОНМК — острое нарушение мозгового кровообращения; ТЭЛА — тромбоэмболия легочной артерии; ХСН — хроническая сердечная недостаточность; ВИЧ — вирус иммунодефицита человека; вкДНК — внеклеточная ДНК; нук Н3.1 — нуклеосомы Н3.1. Fig. 1. The study's patient selection scheme Note: CKD — End-stage chronic kidney disease; CVA — acute cerebrovascular accident (stroke); PE — pulmonary embolism; HF — congestive heart failure; HIV — Human Immunodeficiency Virus; cfDNA — Cell free DNA; Nu.H3.1 — nucleosomes containing histones of the H3.1 type.
Работа была одобрена локальным этическим комитетом ГБУЗ «ГКБ им. С.С. Юдина» (протокол № 5 от 11.01.2023).
Расчет необходимого размера выборки для двусторонней альтернативной гипотезы производился исходя из мощности 80 %, частоты ошибки I рода 5 %, он был произведен в программе MedCalc Software Ltd. Sample size for Single mean. https://www.medcalc.org/calc/sample-size-single-mean.php (Version 23.3.5; accessed August 16, 2025). На основании предполагаемых величин эффекта (разницы средних) и вариабельности (стандартного отклонения) минимальный объем выборки для каждой группы составил 8 человек.
Сбор данных
Демографические, клинические, лабораторные и инструментальные данные пациентов были собраны и проанализированы в первые 24 ч с момента манифестации септического шока (табл. 1).
Клиническая оценка: включала тяжесть состояния по шкалам APACHE II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II), SOFA (Sequential Organ Failure Assessment). Регистрировали госпитальные исходы лечения, длительность пребывания в реанимации, искусственной вентиляции легких (ИВЛ) и вазопрессорной терапии.
Гемодинамический мониторинг: наряду со стандартным мониторингом (электрокардиография, пульсовая оксиметрия) проводили контроль артериального давления и эхокардиографию.
Лабораторный контроль: включал общий и биохимический анализы крови, анализ кислотно-щелочного состояния, коагулограмму, водно-электролитные показатели. Кроме того, определяли интерлейкин 6 (ИЛ-6), прокальцитонин (электрохемилюминесцентный метод, Lifortonic eCL8000), C-реактивный белок (СРБ), ферритин, белки системы комплемента C3 и С4, (иммунотурбидиметрия, Mindray BS 800), ингибитор С1 фактора комплимента (флуориметрический метод, Qubit4 Thermo FS), уровень фактора фон Виллебранда, D-димера (иммунотурбидиметрический метод, Sismexc SC 5100), протеин S, С, антитромбин III (хромогенный, фотометрический метод, Destiny Max).
Помимо стандартных лабораторных показателей, производили измерение концентрации нуклеосом Н3.1 (нук Н3.1) с помощью методики Nu.Q H3.1® (Belgian Volition SRL, Бельгия), согласно инструкции производителя, и определение вкДНК методом «НуклеоТест» (НПФ ПОКАРД, Россия).
«НуклеоТест» — хромогенный метод определения концентрации ДНК-содержащих структур, основанный на способности ДНК взаимодействовать с гистоном Н1.3 человека. В лунки планшета для иммуноферментного анализа с предварительно иммобилизованным гистоном Н1.3 вносили тестируемые образцы плазмы пациентов, затем — коньюгат гистона Н1.3 с пероксидазой. Концентрацию ДНК в образцах определяли спектрофотометрически по окрашиванию при 450 нм. Калибровочную зависимость строили с использованием очищенного препарата ДНК. Метод позволяет количественно определять уровень ДНК-содержащих структур в плазме крови человека.
Интенсивную терапию проводили в соответствии с рекомендациями «Септический шок у взрослых» (клинические рекомендации ФАР, Surviving Sepsis Campaign, 2021) [16, 17].
Статистический анализ
При статистической обработке использовались стандартные пакеты программы SPSS v.26 (SPSS Inc., США). Для определения нормальности распределения количественных переменных использовались тесты Шапиро—Уилка и Колмогорова—Смирнова, оценка эксцесса и асимметрии. Если переменные соответствовали нормальному распределению, то их значения представлялись как среднее и стандартное отклонение (М ± SD). Если распределение количественной переменной не соответствовало нормальному, их значения представлялись в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона (25–75 %). Номинальные (качественные) значения указаны в абсолютных числах (n) и процентах (%).
Коэффициент Спирмена (r) использовался для оценки корреляций между количественными (при распределении, отличном от нормального) и порядковыми переменными, а при нормальном распределении применялся коэффициент Пирсона.
Для определения независимых предикторов высокого уровня вкДНК, в который вошли все статистически значимые корреляции (p < 0,1), использовался парный и множественный линейный регрессионный анализы. Многомерная линейная регрессия выполнялась методом пошагового исключения.
Для выявления зависимости уровня нук Н3.1 c госпитальным летальным исходом и осложнениями у больных с септическим шоком использовался анализ под характеристической кривой. Отрезную точку выбирали с учетом значений индекса Юдена и сопоставления отношения шансов для высоких и низких значений показателя. Чувствительность, специфичность, предсказательную ценность положительного и отрицательного результатов рассчитывали с помощью таблиц сопряжения.
Статистически значимыми считались различия при значениях двустороннего р < 0,05.
Результаты
Окончательное число пациентов, вошедших в исследование, составило 52 человека (64 % мужчин, 36 % женщин) в возрасте 52,1 ± 17,3 года. Индекс массы тела (ИМТ) испытуемых приближался к ожирению первой степени (29,0 ± 6,2) кг/м2. Все пациенты соответствовали критериям септического шока (оценка органной дисфункции и прогнозирование смертности по шкалам SOFA и APACHE II составили 10 ± 4 и 22 ± 7 баллов соответственно, медиана уровня лактата и прокальцитонина — 2,4 [1,7–4,0] ммоль/л и 15,7 [5,0–60,5] г/л соответственно, медиана дозировки норэпинефрина — 0,52 [0,33–0,87] мкг/кг/мин). Основные демографические, клинико-лабораторные и инструментальные данные представлены в табл. 1.
| Общая группа (n = 52) | |
|---|---|
| Демографические показатели | |
| Возраст, лет | 52,1 ± 17,3 |
| Пол (муж.), % | 64,0 |
| ИМТ, кг/м2 | 29,0 ± 6,2 |
| Этиология септического шока | |
| Абдоминальный, % (n) | 35,9 % (18) |
| Пульмоногенный, % (n) | 37,5 % (19) |
| Урологический, % (n) | 12,5 % (7) |
| Инфекция кожи и мягких тканей, % (n) | 9,0 % (5) |
| Прочее, % (n) | 5,1 % (3) |
| Клинические данные | |
| SOFA, баллы | 10,0 ± 4,0 |
| APACHE II, баллы | 22,0 ± 7,0 |
| ЧСС, уд/мин | 103,0 ± 23,0 |
| Среднее АД, мм рт. ст. | 61,7 ± 8,0 |
| Норэпинефрин, мкг/кг/мин | 0,52 (0,33–0,87) |
| Длительность пребывания в стационаре, сутки | 9,0 (6,0–16,0) |
| Длительность пребывания в ОРИТ, сутки | 7,0 (4,0–11,0) |
| Длительность ИВЛ, сутки | 5,0 (3,0–10,0) |
| Длительность в/п поддержки, сутки | 5,0 (3,0–10,0) |
| Инструментальные данные | |
| ФВ лж, % | 59,0 (47,0–63,0) |
| КДО, мл | 95,0 (78,0–118,0) |
| СДЛА, мм рт. ст. | 35,0 ± 11,0 |
| Лабораторные данные | |
| Индекс оксигенации | 300,0 ± 138,0 |
| Лактат, ммоль/л | 2,4 (1,7–4,0) |
| Лейкоциты, ×109/л | 17,3 (10,6–24,4) |
| Нейтрофилы, ×109/л | 14,9 (7,9–25,5) |
| Палочкоядерные нейтрофилы, % | 8,0 (4,0–19,0) |
| Лимфоциты, ×109/л | 8,0 (5,0–12,5) |
| Тромбоциты, ×109/л | 137,0 (89,0–220,0) |
| ИЛ-6, пг/мл | 434,0 ± 387,2 |
| СРБ, мг/л | 212,5 ± 88,1 |
| Прокальцитонин, нг/мл | 15,7 (5,0–60,5) |
| Ферритин, нг/мл | 974,5 (555,0–1213,0) |
| Фибриноген, г/л | 5,9 ± 2,3 |
| Антитромбин III, % | 45,8 (32,7–64,7) |
| D-димер, нг/мл | 5971,4 (2161,0–12066,0) |
| Протеин С, % | 57,8 ± 24,3 |
| Протеин S, % | 61,7 ± 31,0 |
| Фактор фон Виллебранда, % | 521,5 ± 246,6 |
| Холестерин, ммоль/л | 3,0 ± 1,3 |
| Триглицериды, ммоль/л | 2,3 (1,5–4,2) |
| Мочевая кислота, мкмоль/л | 350,2 (234,8–463,4) |
| Альбумин, г/л | 27,3 ± 5,3 |
| Билирубин, мкмоль/л | 18,8 (7,7–34,6) |
| АЛТ, МЕ/л | 38,7 (24,2–99,2) |
| АСТ, МЕ/л | 57,4 (27,4–159,6) |
| Креатинин, мкмоль/л | 220,1 (117,9–356,8) |
| C3, г/л | 0,9 ± 0,3 |
| С4, г/л | 0,21 (0,14–0,29) |
| С1-ингибитор, мг/дл | 9,0 (0,5–22,0) |
| ВкДНК, нг/мл | 3041,0 (876,0–7815,0) |
| Нук Н3.1, нг/мл | 4658,0 ± 3962,0 |
| Клинические события | |
| 28-дневная летальность, % (n) | 69,8 % (36) |
| Тромботические осложнения, % (n) | 26,4 % (13) |
| Острое повреждение почек, % (n) | 75,5 % (39) |
Медиана концентрации вкДНК, определенная методом «НуклеоТест» у пациентов с септическим шоком, составила 3041 (876–7815,0) нг/мл, а уровень нук Н3.1 — 4658 ± 3962 нг/мл. Летальность в течение 28 дней была высокой (69,8 %) и соответствовала частоте смертности в общей популяции больных с септическим шоком [18]. У 75 % испытуемых состояние осложнилось ОПП, которое нуждалось в проведении заместительной почечной терапии. Иное осложнение (тромбоз вен нижних конечностей, ассоциированный с сепсисом) встречался в 25 % случаев.
Корреляционный анализ концентрации нук Н3.1 позволил выявить статистически значимые связи среди вышеприведенных показателей у пациентов с септическим шоком (табл. 2).
| Нук Н3.1 | ||
| Показатель | rxу | p |
|---|---|---|
| Клинические шкалы | ||
| SOFA | 0,41 | 0,002 |
| APACHE II | 0,3 | 0,04 |
| Система гемостаза | ||
| Фактор фон Виллебранда | 0,35 | 0,02 |
| Система комплемента | ||
| С3 | –0,39 | 0,005 |
| С4 | –0,33 | 0,02 |
| Ферменты печени | ||
| Билирубин | 0,36 | 0,01 |
| АЛТ | 0,3 | 0,03 |
| АСТ | 0,28 | 0,04 |
| Медиаторы воспаления | ||
| ИЛ-6 | 0,39 | 0,04 |
| Другие показатели | ||
| Индекс оксигенации | –0,37 | 0,008 |
| Креатинин | 0,29 | 0,04 |
| Лактат | 0,4 | 0,004 |
| ВкДНК | 0,67 | 0,0001 |
Наиболее значимые корреляции нук Н3.1 регистрировались с уровнем лактата (прямая связь средней силы: rxy = 0,4; р = 0,004) и шкалой SOFA (прямая связь средней силы: rxy = 0,41; р = 0,002). Также прямая связь средней силы отмечалась между нук Н.3.1 и уровнем ИЛ-6 (rxy = 0,39; р = 0,04). Кроме того, стоит отметить, что корреляция между двумя маркерами NETs — вкДНК и нук Н3.1 — обладала сильной прямой связью (rxy = 0,67; р = 0,0001) (рис. 2).
Рис. 2. График регрессионной функции, отображающий зависимость уровня внеклеточной ДНК от нук Н3.1 Fig. 2. The regression function showing the dependence of the cell free DNA level on the Nu.H3.1
В дальнейшем при помощи парной и множественной линейной регрессии производилась оценка зависимости влияния статистически значимых показателей, выявленных в корреляционном анализе, на концентрацию нук Н3.1 у пациентов с септическим шоком, включенных в исследование (табл. 3).
| Парная регрессия | R/R2 | β-коэффициент | р | Множественная регрессия | р | р | R/R2 | R скорректированный |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| SOFA | 0,41/0,17 | 414,2 | 0,02 | APACHE II | 0,003 | 0,0001 | 0,74/0,51 | 0,47 |
| APACHE II | 0,29/0,08 | 175,3 | 0,04 | Лактат | 0,003 | |||
| Индекс оксигенации | 0,37/0,13 | –10,5 | 0,008 | Билирубин | 0,02 | |||
| Лактат | 0,41/0,17 | 656 | 0,002 | АЛТ | 0,009 | |||
| ИЛ-6 | 0,39/0,15 | 4,2 | 0,04 | — | — | — | — | — |
| Фактор фон Виллебранда | 0,35/0,12 | 6,0 | 0,02 | — | — | — | — | — |
| Билирубин | 0,35/0,12 | 26,2 | 0,02 | — | — | — | — | — |
| АЛТ | 0,38/0,15 | 2,6 | 0,005 | — | — | — | — | — |
| АСТ | 0,46/0,21 | 1,0 | 0,001 | — | — | — | — | — |
| С3 | 0,39/0,15 | –4965 | 0,005 | — | — | — | — | — |
Наиболее значимые взаимосвязи нук Н3.1 при парной регрессии были выявлены с суммой баллов по шкале SOFA, уровнями лактата смешанной венозной крови и АСТ. Однако по результатам множественной регрессии в итоговую регрессионную модель, имеющую тесную связь по шкале Чеддока (коэффициент корреляции rxy = 0,74), вошли сумма баллов по шкале APACHE II, концентрации лактата, билирубина и АЛТ. Уровень значимости данной модели составил р < 0,0001, а сочетание указанных факторов выявленной модели определяло 47 % дисперсии нук Н3.1.
Согласно результатам проведенного ROC-анализа, AUC нук Н3.1 имела статистическую значимость в отношении 28-дневной госпитальной летальности и ОПП у больных с септическим шоком (табл. 4, рис. 3).
Рис. 3. Площади под характеристической кривой концентрации нук Н3.1 в отношении (А) 28-дневной летальности и (В) острого повреждения почек у пациентов с септическим шоком Fig. 3. The area under the characteristic curve of the concentration of Nu.H3.1 in relation to (А) 28-day mortality and (В) acute kidney injury in patients with septic shock
| Показатель | Острое повреждение почек | Тест ДеЛонга | 28-дневная летальность | Тест ДеЛонга | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| AUC (95% ДИ) | р | AUC (95% ДИ) | р | |||
| Нук Н 3.1 | 0,74 (0,57–0,90) | 0,014 | Р1–2 = 0,37 | 0,68 (0,53–0,84) | 0,037 | Р1–2 = 0,92 |
| вкДНК | 0,67 (0,51–0,83) | 0,076 | 0,69 (0,54–0,84) | 0,031 | ||
При сравнении AUC нук Н3.1 и вкДНК статистически значимых различий выявлено не было, что в целом позволяет рассматривать данные показатели, как равноценные в предсказании клинических событий — ОПП и 28-дневной летальности.
При разделении выборки больных с септическим шоком на наличие/отсутствие ОПП медиана концентрации нук Н3.1 в группе больных с ОПП статистически значимо различалась в сравнении с группой без него (4252 [1700–8488] vs 2283 [369–3034] нг/мл; р = 0,014) (рис. 4А, В), аналогичное различие отмечалось при сравнении концентрации нук Н3.1 у пациентов с септическим шоком, умерших в течение 28 дней госпитализации и выживших за данный период времени (1925 [933–4084] vs 4153 [1939–8949] нг/мл; р = 0,037) (рис. 4, C, D).
Рис. 4. Сравнительный анализ медиан концентраций нук Н3.1 и распределение пациентов в зависимости от нее у больных с септическим шоком и наличием/отсутствием острого повреждения почек (А, В), а также среди умерших/выживших за 28 дней (C, D) Fig. 4. Comparative analysis of median Nu.H3.1 in patients with septic shock with or without acute kidney injury (А, В), as well as those who died and survived for a period of 28 days (C, D)
ОШ для развития ОПП при концентрации нук Н3.1 > 2731 нг/мл составило 6,0 (95% ДИ 1,6–26,0; р < 0,018), чувствительность, специфичность — 67 и 75 % соответственно. Для 28-дневной летальности при концентрации нук Н3.1 > 2731 нг/мл ОШ составило 4,4 (95% ДИ 1,2–15,6; p = 0,03), чувствительность и специфичность — 67 и 79 % соответственно.
Обсуждение
Неизменно высокие заболеваемость и смертность при сепсисе обусловливают актуальность поиска новых стратегий диагностики и терапевтических мишеней [19]. Использование диагностических и прогностических маркеров при сепсисе связано с рядом трудностей, доминирующей из которых является сложный патогенез, включающий гипервоспаление, нарушения коагуляции, эндотелиальную дисфункцию, вазодилатацию и органное повреждение [20]. В этом ключе ДНК-содержащие структуры — вкДНК и NETs — представляются перспективными биомаркерами, так как их патофизиологическая роль при сепсисе связана с активацией и иммунной, и свертывающей систем, а также с повреждением эндотелия и микроциркуляторного русла и, как следствие, с множественным повреждением органов. ДНК-содержащие структуры имеют свойства так называемого идеального биомаркера септического процесса, и современные диагностические возможности его определения представлены множеством лабораторных методик, которые можно использовать не только в исследовательских целях, но и в реальной клинической практике [20].
При септическом шоке повреждение клеток, тканей и гипервоспаление протекают синхронно с взаимным потенцированием. Вероятно, параллельный мониторинг и вкДНК, как маркера клеточного повреждения и интенсивности воспалительного ответа, и уровня NETs, характеризующего активность клеточного иммунитета и фагоцитоза, безусловно обеспечит преимущества диагностики для пациентов. Компонентный состав и этиология ДНК-содержащих структур у септических больных остаются изученными недостаточно [21]. В нашей работе показана интересная сильная прямая корреляционная связь между концентрацией вкДНК и нук Н3.1 (rxy = 0,67; р = 0,0001). Нам удалось найти лишь одно исследование, в котором у пациентов с сепсисом проводилось измерение концентрации и вкДНК, и маркера NETs — MPO-DNA, но корреляция между ними не была изучена [22, 23].
Продемонстрированные нами корреляции NETs c классическими прогностическими и оценочными шкалами APACHE II и SOFA, индексом оксигенации, маркерами эндотелиальной дисфункции, гипервоспаления, органной дисфункции могут быть объяснены как прямым повреждающим действием нейтрофильных ловушек, так и вторичным тканевым повреждением вследствие гипоперфузии [24–26].
При парной регрессии наиболее сильную связь с повышением уровня NETs показали сумма баллов по шкале SOFA (р = 0,02), уровень лактата (р = 0,002) и АСТ (р = 0,001),
но при множественной регрессии свою зависимость от NETs сохранили лишь APACHE II, лактат, билирубин и АЛТ (коэффициент корреляции rxy = 0,74). Мы не нашли клинических исследований, описывающих зависимость концентрации нуклеосом и показателей печеночной дисфункции в доступных нам источниках литературы, но стоит подчеркнуть известную роль макрофагальной системы печени в клиренсе ДНК-содержащих структур, также следует упомянуть о значительном вкладе ДНК гепатоцитов в общий пул вкДНК при сепсисе [27, 28]. Таким образом, повреждение печени при септическом шоке играет двойную роль относительно ДНК-содержащих структур, повышая их образование за счет цитолиза и снижая скорость элиминации [29].
Значимая связь лактата и уровня NETs, показанная в нашей работе, соответствует принятой концепции влияния гипервоспаления на снижение тканевой перфузии при сепсисе. Однако подобные результаты показали только для вкДНК [30].
Прямые связи уровня NETs cо степенью выраженности полиорганной дисфункции, определенной по шкалам APACHE II и SOFA, показаны в ретроспективном исследовании Su Y. et al., включившем 120 пациентов с сепсисом. Концентрация нуклеосом в группе с оценкой по шкале APACHE II > 20 была выше, чем в группах 11–20 и 0–10 баллов (все р < 0,001). Уровень нуклеосом в группе с оценкой по шкале SOFA > 10 баллов был выше, чем в группах 6–10 и 0–5 баллов (все р < 0,001) [23].
Аналогично нашим результатам в крупнейшем на сегодня исследовании Filippini D.F.L. et al., включившем 1700 пациентов ОРИТ, описаны прямые корреляции маркеров образования NETs и провоспалительных цитокинов, а также слабые положительные ассоциации с СРБ [11, 31, 32]. Это можно объяснить провоспалительными эффектами нейтрофильных ловушек, способных индуцировать выброс в кровоток цитокинов другими клетками, а также попаданием в кровоток через разрушенную мембрану нейтрофилов везикул с медиаторами воспаления, что происходит с выбросом хроматина из ядра при образовании NETs [33]. Таким образом, содержание ДНК-содержащих структур в кровотоке может рассматриваться как новый диагностический фактор гипервоспалительного фенотипа сепсиса [11, 34].
Нами показана обратная корреляция уровня NETs и белка С3 системы комплемента. Это может быть объяснено способностью нейтрофильных ловушек напрямую активировать белки этой системы для усиления антиинфекционной защиты при бактериальных инфекциях, что показано в исследованиях Leffler J. et al. и Wang H. et al. [35, 36]. Также комплемент участвует в естественной элиминации NETs, опсонизируя их, что способствует распознаванию и фагоцитозу NETs макрофагами [37]. Таким образом, избыточное образование NETs может приводить к истощению пула белков комплемента в кровотоке [38].
Взаимодействие NETs с фактором фон Виллебранда в норме является одной из ключевых интеграций гемостаза и необходимо для локализации инфекционного агента, при сепсисе оно приобретает неконтролируемый характер, что приводит к повреждению эндотелия, депонированию компонентов NETs в его гликокаликсе, развитию иммунотромбоза. Компоненты NETs вызывают снижение активности металлопротеиназы ADAMTS13, что поддерживает высоким уровень фактора фон Виллебранда [39]. Это объясняет найденную в нашем исследовании прямую ассоциацию NETs и фактора фон Виллебранда. Клинических исследований, демонстрирующих связи двух этих показателей, нами не было найдено, однако в работе Mao J.Y. et al. показана корреляция уровней NETs и маркера повреждения гликокаликса эндотелия синдекана-1 (r = 0,6383, p < 0,0001). Из значимых результатов данного исследования стоит выделить ассоциацию наличия ДВС-синдрома с более высоким уровнем нуклеосом (140 [47–233] vs 307 [199–415] нг/мл; [p < 0,0001]) и выявление NETs как независимого фактора риска его развития (ОШ 1,0104; 95% ДИ 1,0032–1,0176) [40]. В работах Su Y. et al. и Filippini D.F.L. et al. также описаны корреляции избыточных уровней NETs с высокой частотой развития сепсис-индуцированной коагулопатии и ДВС-синдрома [11, 23].
Корреляционная связь оксигенирующей функции легких и уровня NETs, показанная в нашем исследовании, описана во множестве работ — в популяции больных как с сепсисом, так и с острым респираторным дистресс-синдромом и COVID-19 [11, 34]. Например, в исследовании Middleton E.A. et al. комплексы МПО-ДНК в плазме увеличивались при прогрессировании COVID-19 и были связаны со снижением индекса оксигенации [41]. Компоненты NETs (гистоны, гранулярные белки) и сама ДНК способны вызывать как прямое, так и вторичное (вследствие воспаления) повреждение и эндотелия сосудов микроциркуляции легких, и эпителиальных клеток альвеол, вызывая отек легочной ткани, что может объяснить неблагоприятное воздействие нейтрофильных ловушек на респираторную функцию при сепсисе [42].
Наше исследование продемонстрировало значимую прогностическую способность как вкДНК, так и уровня NETs в отношении риска развития летального исхода и ОПП, что можно отнести к наиболее важным из установленных фактов. В доступной нам литературе мы не нашли исследований, описывающих предсказательную способность нук Н3.1 в отношении ОПП при очевидной патофизиологической роли нейтрофильных ловушек в развитии повреждения почек [43–45].
В отношении риска летального исхода в исследовании Filippini D.F.L. et al. показано, что уровень нуклеосом H3.1 был достоверно связан с 28-дневной летальностью при коррекции на возраст и пол, но эта связь исчезла после коррекции на SOFA. У пациентов с исходной концентрацией нуклеосом, содержащих гистоны типа H3.1 > 1000 нг/мл, наблюдалась более высокая вероятность 28-дневной летальности (ОР 1,68; 95% ДИ 1,35–2,10; р < 0,001) [11]. ДНК-содержащие структуры представляют значительный интерес в качестве потенциальных мишеней для экстракорпоральной терапии, особенно в связи с появлением селективных гемосорбентов, способных элиминировать их из кровотока [14, 15]. При всех предполагаемых клинических преимуществах такого вмешательства остаются неясными существенные вопросы об уровне ДНК-содержащих структур, являющемся показанием для инициации экстракорпоральной терапии, и сроках ее начала. В нашем исследовании показана ассоциация NETs с двумя важнейшими клиническими событиями — летальностью и развитием ОПП. При уровне нук Н3.1 > 2731 нг/мл шанс развития первого увеличивался в 4 раза, второго — в 6 раз. Подобный дискретный уровень продемонстрирован в самом крупном на данный момент исследовании нуклеосом при сепсисе Haem Rahimi M. et al. с участием 151 пациента: оптимальным пороговым значением, предсказывающим летальный исход, было 4639 нг/мл. В исследовании Morimont L. et al., в которое вошли 20 больных с септическим шоком, средний уровень нуклеосом Н3.1, ассоциированный с летальным исходом, составил 1776 (402–16 032) нг/мл. В исследовании Cavalier E. et al. на когорте пациентов с COVID-19 пороговым уровнем, определяющим тяжесть течения заболевания и необходимость лечения в отделении интенсивной терапии, было 1250 нг/мл [26, 32, 46]. Очевидная гипотеза заключается в том, что указанные уровни и являются показаниями для начала экстракорпоральной элиминации ДНК-содержащих структур. Однако необходимы дальнейшие исследования в данном направлении.
Ограничения исследования
Указанные нерешенные вопросы в лечении септического шока и очевидный мотив оптимизировать его интенсивную терапию путем поиска значимых медиаторов (потенциальных мишеней для экстракорпоральной элиминации) могли бы быть источником субъективных смещений в данном исследовании. Указанные сомнения могут быть усилены тем фактом, что подобных исследований крайне мало, а полученные результаты в значительной степени уникальны. Однако транспарентный дизайн исследования, включающий измерение уровня изучаемых медиаторов вне клиники (в отдельной лаборатории), исключает такую возможность. Исходя из этого, обнаруженные связи изучаемых биомаркеров с другими клинико-лабораторными показателями и исходами лечения сепсиса рассматриваем как объективное свидетельство прогностического значения уровней вкДНК и нуклеосом. С другой стороны, целесообразность элиминации этих субстанций при септическом шоке является лишь рабочей гипотезой, поскольку их значение как маркера либо как активного медиатора септического процесса невозможно идентифицировать. Другим более очевидным ограничением является одноцентровой характер нашей работы. Нельзя исключить влияние на результаты как явных (внутрибольничные приказы), так и «латентных» (так называемые стиль, манера и субъективные предпочтения при проведении лечебных мер) госпитальных протоколов ведения больных в отделении реанимации. Вместе с тем дизайн исследования легко воспроизводим в других клиниках и в рамках многоцентрового исследования, необходимость которого не вызывает сомнений.
Заключение
В исследовании показано, что маркер образования NETs (уровень нук Н3.1) является независимым предиктором летальности и развития ОПП при септическом шоке, выявлена его пороговая концентрация, связанная со значительным повышением вероятности наступления этих значимых клинических событий, которая может быть рассмотрена как лабораторный ориентир при определении показаний экстракорпоральной элиминации из кровотока ДНК-содержащих структур.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Disclosure. The authors declare no competing interests.
Вклад авторов. Все авторы в равной степени участвовали в разработке концепции статьи, получении и анализе фактических данных, написании и редактировании текста статьи, проверке и утверждении текста статьи.
Author contribution. All authors according to the ICMJE criteria participated in the development of the concept of the article, obtaining and analyzing factual data, writing and editing the text of the article, checking and approving the text of the article.
Этическое утверждение. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ГБУЗ «ГКБ им. С.С. Юдина ДЗМ» (протокол № 5 от 11.01.2023).
Ethics approval. This study was approved by the local Ethical Committee of S.S. Yudin City Clinical Hospital (reference number: 5-11.01.2023).
Информация о финансировании. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.
Декларация о наличии данных. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.
Data Availability Statement. The data that support the findings of this study are available from the corresponding author upon reasonable request.
